单抗制备技术对比
单克隆抗体（Monoclonal antibodies，mAb）是由B细胞产生，并能特异性靶向抗原的免疫球蛋白。单克隆抗体不仅是生物化学、分子生物学和医学研究中必不可少的工具，其在临床治疗上的应用也以革命性的速度改进了多种疑难杂症的治疗方法。
1975年Köhler和Milstein提出的杂交瘤技术（Hybridoma technology），使得大量获得单克隆抗体成为可能，为基础研究及其临床应用提供了无限潜力。其他科学和技术进步也促进了单克隆抗体的发展、丰富了单克隆抗体的制备方法。
经过近50年的发展，单克隆抗体制备方法不再局限于免疫小鼠的淋巴细胞术，噬菌体展示技术（Phage display）、人源抗体转基因小鼠（Human antibody-producing mice）和单B细胞抗体技术（Single B cell antibody technology）也都陆续登上舞台。这些方法虽然有各自的局限性，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选。同时，这些技术都不完全是独立存在的，如果能充分利用各技术的优点，采用灵活的方法将各技术优化组合就能更加高效、快速地进行抗体开发。
1. 杂交瘤技术
杂交瘤技术是一种将B细胞与骨髓瘤细胞融合生产小鼠单克隆抗体的传统方法，是目前应用最广泛的单克隆生产技术。在这种技术中，首先收集免疫小鼠的B淋巴细胞，并将其与BALB/c小鼠骨髓瘤细胞融合，从而形成永生化的杂交瘤细胞。然后筛选杂交瘤细胞，鉴定出能生产特异性抗体的单克隆细胞株。十几年后，1988年，兔单克隆抗体制备方法首次被《Science》杂志报道 [1]。该研究使用小鼠-兔异种杂交瘤方法生产兔单克隆抗体，但鼠-兔异种杂交瘤细胞分泌抗体的效率较低、不稳定，且无法长时间分泌抗体。时间进展到90年代中期，1995年，《PNAS》报道了能稳定生产兔单抗的兔-兔杂交瘤细胞 [2]。但兔杂交瘤细胞也被证明不如常规鼠杂交瘤细胞稳定，这大大阻碍了其实验室水平的广泛使用。并且，由于融合和转化效率低下，使用兔杂交瘤细胞生产单克隆抗体在应用推广中受到了极大的限制。
经过多年发展及应用，杂交瘤技术作为一种成熟的产生鼠单克隆抗体的方法已被广泛应用于多种抗体的生产。然而，由于缺乏合适的骨髓瘤融合伴侣，杂交瘤技术一直局限于免疫啮齿动物。20世纪80年代，《PNAS》报道了一种应用人杂交瘤技术生产治疗用抗体的文章 [3]。利用该方法可以在无额外修饰的情况下产生天然的人源抗体，并用于临床治疗。随着融合伴侣和电融合技术的发展，人杂交瘤细胞融合成功率逐步增加，这将在未来促进治疗性抗体的开发。
2. 噬菌体展示技术
1990年开始，噬菌体展示技术被视为一种新的产生单克隆抗体的方法。这种方法是从淋巴细胞中收获抗体可变区基因（V gene）全集，克隆VHs和VLs的组合并与外壳蛋白融合后表达于丝状噬菌体表面，然后筛选表达特异性抗体的噬菌体。与受限于啮齿动物的杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术已经成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物种中筛选和分离单克隆抗体 [4,5]。2000年，Rader等人首次介绍了应用噬菌体展示技术生产兔单克隆抗体的全过程 [6]。在这篇文章中，Rader等人用噬菌体展示技术筛选和人源化的人A33兔抗体，不仅对人A33抗原有高特异性，且保留高亲和力。目前，噬菌体展示技术因为其高效、简便及体外控制在原核或真核系统中原则参数的能力正逐步成为生产治疗用抗体的重要技术平台。
随着我们对抗体结构、功能和序列多样性研究的不断深入，除了原有的抗体库外，一种新的合成抗体库技术也在不断发展。例如，HuCAL&Ylanthia文库中，为了使筛选出的人源抗体能更好的进行分子识别，将精确设计的序列插入抗原结合位点，并优化设计多种可变重链、轻链框架区域 [7-10]。随着文库设计和筛选方法的不断进步，合成抗体文库将成为快速生产具有高特异性和高亲和力单克隆抗体不可或缺的工具。
3. 人源抗体转基因小鼠
1985年，Alt等人首次提出将人抗体基因引入小鼠种系并使用转基因小鼠中产生人抗体的想法 [11,12]。随着基因编辑技术的进步，使用人源抗体转基因小鼠生产人源化抗体已不再是天方夜谭。与其他技术相比，使用人源抗体转基因小鼠有许多优势，如无需人源化、具有更多的生物多样性，且由于体内成熟具有天然的亲和力。但是，人免疫球蛋白体量庞大对转基因小鼠抗体生产是一个巨大的挑战。为了克服这些困难，研究人员们通过使用不同策略已成功地获得转基因动物表达的人源抗体库，如全人源抗体小鼠和嵌合人源抗体小鼠等。
4. 单B细胞抗体技术
虽然杂交瘤技术和噬菌体展示技术已经在单克隆抗体生产中广泛应用，但它们依然存在较难克服的缺点制约着抗体生产过程。近些年，为了克服杂交瘤技术细胞融合效率低，噬菌体展示技术导致重链、轻链的天然同源配对丢失等问题，单B细胞抗体技术正被逐步开发和应用。
简单来说，单B细胞抗体技术包含以下几个步骤：
a. 从外周血或免疫器官中初步提取淋巴细胞；
b. 使用磁性活化细胞分选（MACS）或荧光活化细胞分选（FACS）技术鉴定和分离出特定的B细胞；
c. 将分离出的B细胞进行单细胞培养；
d. 使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和抗体特异性引物鉴定单B细胞分泌抗体的特异性；
e. 扩增特异抗体基因；
f. 将抗体基因克隆到表达载体中，并在细菌或细胞系统中表达；
g. 纯化表达产生的抗体，并用ELISA等方法进行评估。
单B细胞抗体技术现在已广泛用于人和小鼠单克隆抗体生产，如一些治疗性中和单抗，可用于治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病亡 [13,14]。
| 方法 | 杂交瘤技术 | 人源抗体转基因小鼠 | 噬菌体展示技术 | 单B细胞抗体技术 |
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| 优势 |
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| 劣势 |
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参考文献
[1] Raybould TJ, Takahashi M. Production of stable rabbit-mouse hybridomas that secrete rabbit mAb of defined specificity. Science (1988) 240:1788–90. doi:10.1126/science.3289119
[2] Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam PC, Knight KL. Rabbit monoclonal anti-bodies: generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas. Proc Natl Acad Sci U S A (1995) 92:9348–52. doi:10 073/pnas.92.20.9348
[3] Olsson L, Kaplan HS. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 77:5429–31. doi:10.1073/pnas.77.9.5429
[4] Lowe D, Jermutus L. Combinatorial protein biochemistry for therapeutics and proteomics. Curr Pharm Biotechnol (2004) 5:17–27. doi:10.2174/ 1389201043489585
[5] Peterson NC. Advances in monoclonal antibody technology: genetic engineering of mice, cells, and immunoglobulins. ILAR J (2005) 46:314–9. doi:10.1093/ilar.46.3.314
[6] Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, et al. The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies. J Biol Chem (2000) 275:13668–76. doi:10.1074/jbc.275.18.13668
[7] Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P , Fischer M, Wellnhofer G, et al. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol (2000) 296:57–86. doi:10.1006/jmbi.1999.3444
[8] Rothe C, Urlinger S, Lohning C, Prassler J, Stark Y , Jager U, et al. The human combinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all six CDRs according to the natural immune system with a novel display method for efficient selection of high-affinity antibodies. J Mol Biol (2008) 376:1182–200. doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018
[9] Tiller T, Schuster I, Deppe D, Siegers K, Strohner R, Herrmann T, et al. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties. MAbs (2013) 5:445–70. doi:10.4161/mabs.24218
[10] Shim H. Synthetic approach to the generation of antibody diversity. BMB Rep (2015) 48:489–94. doi:10.5483/BMBRep.2015.48.9.120
[11] Alt FW, Keith Blackwell T, Yancopoulos GD. Immunoglobulin genes intransgenic mice. Trends Genet. 1985;1:231–6.
[12] Jakobovits A, Amado RG, Yang X, Roskos L, Schwab G. From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol. 2007;25:1134–43
[13] Tiller T. Single B cell antibody technologies. N Biotechnol (2011) 28:453–7. doi:10.1016/j.nbt.2011.03.014 41.
[14] Flego M, Ascione A, Cianfriglia M, Vella S. Clinical development of monoclonal antibody-based drugs in HIV and HCV diseases. BMC Med (2013) 11:4. doi:10.1186/1741-7015-11-4
